Dot-blot для определения рабочей концентрации антител | Практическая молекулярная биология

Подготовка мембраны.

вырезать мембрану нужного размера (по одному блоту для каждого разведения первичных антител);
отметить карандашом положение образцов, так, чтобы минимальное расстояние между ними было ~1cm;
смочить мембрану сначала в mQ, затем в PBS;
приготовить серийные разведения белка в BSA 50ng/µl/PBS;
нанести по 1-2.5µl образцов на мембрану, не касаясь её типом;
подсушить мембрану;
мембрану либо использовать сразу, либо хранить при 2-8⁰С, завернутой в Saran Wrap, в течение 3 месяцев.

Иммунодетекция.

"забивка" мембраны 1h NT на качалке;
отмывка 1x15' и 2х5'в 0.1%Tween/PBS NT;
приготовить несколько разведений первичных антител: 1:100, 1:250, 1:500;
инкубировать 1 блот с каждым разведением 1h NT;
отмыть (п.9);
инкубировать со вторичными антителами 1h NT;
отмыть (п.9);
далее - детектировать, используя ЕCL реагенты.

Пример: разведения рекомбинантного белка (С=4µg/µl):

1µl белка + 199µl BSA (0.1µg/µl) = 20 ng/µl (2.5µl на dot)
10µl (из п.1) + 10 µl BSA = 10 ng/µl (1µl )
4 µl (из п.2) + 16 µl BSA = 2 ng/µl (1µl)
4 µl (из п.3) + 16 µl BSA = 0.4 ng/µl (1µl)

> Методы > Работа с белками > Тестирование антител. Dot-blot для определения рабочей концентрации антител.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Подготовка мембраны Иммунодетекция Пример	При оптимальном разведении чувствительность антител максимальна, но в тоже время они ещё не дают слишком высокого фона на BSA.
Подготовка мембраны. вырезать мембрану нужного размера (по одному блоту для каждого разведения первичных антител); отметить карандашом положение образцов, так, чтобы минимальное расстояние между ними было ~1cm; смочить мембрану сначала в mQ, затем в PBS; приготовить серийные разведения белка в BSA 50ng/µl/PBS; нанести по 1-2.5µl образцов на мембрану, не касаясь её типом; подсушить мембрану; мембрану либо использовать сразу, либо хранить при 2-8⁰С, завернутой в Saran Wrap, в течение 3 месяцев. Иммунодетекция. "забивка" мембраны 1h NT на качалке; отмывка 1x15' и 2х5'в 0.1%Tween/PBS NT; приготовить несколько разведений первичных антител: 1:100, 1:250, 1:500; инкубировать 1 блот с каждым разведением 1h NT; отмыть (п.9); инкубировать со вторичными антителами 1h NT; отмыть (п.9); далее - детектировать, используя ЕCL реагенты. Пример: разведения рекомбинантного белка (С=4µg/µl): 1µl белка + 199µl BSA (0.1µg/µl) = 20 ng/µl (2.5µl на dot) 10µl (из п.1) + 10 µl BSA = 10 ng/µl (1µl ) 4 µl (из п.2) + 16 µl BSA = 2 ng/µl (1µl) 4 µl (из п.3) + 16 µl BSA = 0.4 ng/µl (1µl)