Базовые методы | Практическая молекулярная биология

Снятие клеток с культуральных сосудов

слить старую среду;
2-3 раза промыть клетки HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺) или раствором Версена (~3ml на 25 см²);
залить монослой раствором для снятия клеток (чтобы полностью покрывал: ~1ml на 25 см²; но можно и больше, если не жалко);
инкубировать при 37⁰С, периодически аккуратно покачивая. Обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10' (время зависит от клеточной линии);
когда клетки полностью отделятся от субстрата, добавить полной среды или PBS и тщательно диспергировать клетки;
если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток: осадить центрифугированием ~200g, 5' и ресуспендировать в полной среде;
считать и субкультивировать.

Замораживание клеток

только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде;
просчитать количество живых клеток;
осадить клетки, центрифугируя при 200-400g 5', удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок;
ресуспендировать клетки в концентрации 1*10⁷ - 5*10⁷ клеток/мл в среде для замораживания с сывороткой или 0.5*10⁷ - 1*10⁷ клеток/мл в среде для замораживания без сыворотки;
разлить в ампулы (2ml пробирки с завинчивающимися крышками) для замораживания. Охладить ампулы в ледяной бане 5' (или в холодильнике на +4⁰С);
клетки необходимо замораживать медленно - понижение температуры со скоростью ~1⁰С в минуту (варианты в зависимости от богатства: (i) программируемый холодильник; (ii) специальный контейнер (от Gibco или Stratagene); (iii) пенопластовая коробка с толщиной стенок ~1см. Контейнер или коробка помещаются в морозильник на -70⁰С - -90⁰С ON);
после замерзания ампулы переносят для хранения в жидкий азот.

Размораживание клеток

Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирование) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (ДМСО, глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полной среде.

а. Метод с отмывкой от криоконсеванта

клетки быстро оттаять при 37⁰С на водяной бане;
поместить 1-2ml клеток в ~25ml полной среды, очень аккуратно перемешать;
центрифугировать клетки при ~80g 2-3' и удалить супернатант;
аккуратно ресуспендировать клетки в полной среде и посчитать количество живых клеток;
рассадить клетки. Количество живых клеток должно быть, по меньшей мере, 3*10⁵ клеток/мл.

б. Метод непосредственной посадки

клетки быстро оттаять при 37⁰С на водяной бане;
посадить клетки в полной среде. Использовать 10-20ml среды на 1ml замороженных клеток. Необходимо сажать не менее 3*10⁵ клеток/мл;
растить клетки от 12 до 24 часов, затем заменить среду свежей чтобы удалить криоконсервант.

Определение количества клеток

Количество клеток в суспензии можно просчитать в камере Горяева. Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются.

Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~40µl) смешивают с равным количеством 0.4% (w/v) раствора красителя в HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество "квадратов", в которых просчитываются клетки зависит от плотности клеточной культуры и от той точности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток).

Зазор 0.1mm
Сторона малого квадрата 0.05 ±0.001mm
Сторона большого квадрата 0.2 ±0.0015mm
Сторона сетки 3 ±0.005mm
Площадь сетки 9mm².
Объем камеры 0.9mm³.

Для клеток неразведённой суспензии:
     С [cell/ml] = 2.5*10⁵*(количество клеток в одном большом квадрате)
     С [cell/ml] = 4*10⁶*(количество клеток в одном малом квадрате)
Для клеток разведённой в два раза (красителем) суспензии:
     С [cell/ml] = 5*10⁵*(количество клеток в одном большом квадрате)
     С [cell/ml] = 8*10⁶*(количество клеток в одном малом квадрате)

Транспортировка

либо (более предпочтительно) в сухом льду, замороженными;

либо при комнатной температуре: клетки выращивают до 60-80% монослоя, удаляют старую среду, культуральный флакон заливают полной средой доверху и плотно закручивают крышкой. При таком способе клетки можно сохранить живыми в течение 2 суток.

NB! На наш взгляд, лучше предварительно "кондиционировать" новую среду в CO₂-инкубаторе.

Комментарии.

Общие.

Данная методика сделана на основе (i) описания в Cell culture references. In Cell Culture. 1998-99 catalogue Life technologies, p. 9-(3-14); (ii) главы "Basic Techniques for Mammalian Cell Tissue Culture" из "Current Protocols in Cell Biology" и (iii) личного опыта авторов.
Здесь приведена общая схема работы с эукариотическими клетками. Оптимальные условия, времена и концентрации для каждой конкретной клеточной линии подбираются опытным путем. На сайтах клеточных коллекций (например, ATCC, DSMZ) можно получить индивидуальную информацию о конкретных линиях и условиях их культивирования.
Клеточные линии допускают сравнительно лёгкое замораживание/оттаивание. Это позволяет "вести" их только тогда, когда это действительно нужно. Нет никакого резона в том, чтобы поддерживать клеточную линию в термостате, а не в жидком азоте. Хранение криоконсервированных образцов позволяет избежать потери культуры в результате инфекционного заражения, уменьшить генетические изменения при непрерывном культивировании, избежать старения или окончательной дифференцировки клеток. Старайтесь работать так, чтобы свести количество пассажей к разумному минимуму. Схема работы с новой клеточной линией:
"разгон" --> "замораживание/проверка" и "проведение экспериментов" --> "сворачивание работы"
Во избежание перекрестного загрязнения культур лучше не использовать одни и те же бутыли со средой и реагентами при работе с различными линиями клеток. Кроме того, пипетки, имевшие контакт с флаконами и бутылями с клетками, нельзя повторно использовать для отбора сред из соответствующих емкостей. Подробнее о правилах стерильной работы смотри в тексте "Стерильная работа". Кстати, по поводу антибиотиков: при аккуратной работе можно вполне без них обойтись.
Используемые среды и растворы перед добавлением к клеткам должны быть прогреты до температуры 37⁰С (по крайней мере, до NT, но никак не "прямо из холодильника").
При пересеве следует отмечать на чашке (матрасе): дату, номер пассажа.

О культуральной посуде.
Обычно культуральная посуда допускает многократное использование (особенно удобно и дёшево, если клетки позволяют растить себя в стеклянной посуде). Если культура одна и та же - просто пересеять на ту же чашку. В противном случае - мыть, стерилизовать ультрафиолетом.
Сравнение культуральных флаконов (матрасов) и чашек Петри.

Чашки Петри	Матрасы
дешевле	дороже
полный и удобный доступ к поверхности	в зависимости от конструкции; иногда "мёртвые зоны"
отличный газообмен	пробки матрасов должны быть закручены неплотно (если это не флаконы с вентилируемыми крышками)
неудобно, что подписываются крышки	нельзя путать неподписанные пробки
к перевозке не приспособлены	можно перевозить
только CO₂-инкубатор (хотя некоторые умельцы запаивают в полиэтиленовый пакет)	для некоторых культур можно использовать простой термостат и плотно завинчивающиеся крышки
	чуть свободнее в обращении

В каталоге фирмы-изготовителя можно найти информацию о площади ростовой поверхности, общем объеме и рабочем объеме среды для культуральной посуды. Примерные объемы сред и растворов.

Тип культуральной посуды	Объем ростовой среды	Объем PBS или р-ра Версена при отмывках	Объем р-ра Версена или трипсин-Версена
25см² матрас 60mm чашка Петри	5ml	2-4ml	1ml
80mm чашка Петри (50см²)	7-10ml	3-5ml	1.5-2ml
75см² матрас	9-15ml	3-5ml	1ml

По пунктам.

Снятие клеток с культуральных сосудов.

Выживаемость клеток в процессе культивирования должна составлять не менее 90%.
Клетки пересеваются при достижении ~90-100% монослоя (в конце логарифмической стадии роста). Можно чуть позже (клетки остаются живыми и через ~3 дня после формирования монослоя), но злоупотреблять этим не надо, так как чувствуют они себя при этом плохо и разгоняются потом медленно.
Оставить (NB! но это сильно зависит от конкретной культуры):
~1/3 для быстрого разгона,
~1/10 для "ведения" культуры,
Доля рассева подбирается для того, чтобы установить удобное и регулярное расписание пересевов (раз или два раза в неделю).

п.1.

Всегда, когда речь идёт об удалении старой среды или отмывочного раствора, удобнее не выливать, а "отсасывать" с помощью насоса (можно водоструйного или слабого электрического) подключенного через ловушку.

п.4.

Точное время инкубации определяется визуально. Либо постучать о край матраса (или покачать его), чтобы увидеть, что большинство клеток стало отслаиваться, либо контролировать под микроскопом, что клетки округлились и отцепились от субстрата.

п.5.

Мы предпочитаем слегка прижимать пипетку ко дну при диспергировании клеток (более сильное дробление, меньше пены).

Тип культуры клеток	Раствор для отмывки	Раствор для диссоциации
* большинство постоянных клеточных линий; * клетки на ранних пассажах; * сильно прикрепляющиеся клетки	HBSS или PBS (без Ca²⁺, Mg²⁺)	0.25% (w/v) трипсин в сбалансированном солевом растворе без кальция и магния
* постоянные клеточные линии; * в случае необходимости сохранить целостность белков клеточной поверхности	HBSS или PBS (без Ca²⁺, Mg²⁺)	0.05% (w/v) трипсин в 0.53mM EDTA
* слабо прикрепляющиеся эпителиальные клетки; * трансформированные фибробласты; * первичные культуры, в случае необходимости сохранить целостность поверхностных белков	HBSS или PBS (без Ca²⁺, Mg²⁺)	EDTA, глицерин на цитрате натрия;0.04% (w/v) трипсин в 0.53mM EDTA, глицерине, цитрате натрия
* крепко прикрепляющиеся клеточные линии на первых пассажах	HBSS или PBS (без Ca²⁺, Mg²⁺)	0.25% трипсин на 1mM EDTA 0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS
* эпителиальные клетки	0.5 -1mM EDTA	0.5-1mM EDTA 0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS
* крепко прикрепляющиеся клетки; * эпителиальные клетки; * некоторые опухолевые клетки	0.5-1mM EDTA	0.25% трипсин с 1 мМ EDTA 0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS без кальция и магния

Замораживание клеток

Клетки должны быть в логарифмической фазе роста (~70-90% монослой). Перед замораживанием клетки должны быть охарактеризованы и протестированы на наличие бактериального или иного заражения.

Лучше через некоторое время высеять одну пробирку, чтобы убедиться, что замораживание прошло нормально.

Для заморозки и последующего хранения клеток могут быть использованы среды различного состава.
(а) Если клетки замораживаются не для роста, а для последующих биохимических исследований, то можно использовать PBS вместо среды с сывороткой.
(б) На основе среды с сывороткой:

полная среда плюс 10% глицерина,
полная среда плюс 10% диметилсульфоксида (DMSO),
50% кондиционированной среды плюс 50% свежей среды с 10% глицерином,
50% кондиционированной среды плюс 50% свежей среды с 10% DMSO.

(в) На основе среды без сыворотки:

50% кондиционированной среды без сыворотки плюс 50% свежей среды без сыворотки с 7.5% DMSO,
свежая среда без сыворотки, содержащая 7.5% DMSO и 10% раствор BSA (cell culture grade).

Существует мнение, что клетки лучше замораживать без антибиотиков и не в ростовой среде, а прямо в сыворотке: 85-90% сыворотка и 15-10% DMSO. Причём эти авторы рекомендуют добавлять DMSO к охлаждённой до 0^оС клеточной суспензии.

В некоторых лабораториях клетки замораживают не медленно, а быстро: в жидком азоте. И всё нормально. Однако в этом случае, хорошо бы подержать клетки при 4-0^оС хотя бы 15', чтобы дать криоконсерванту время проникнуть в клетки.

Глицерол, DMSO и медленное охлаждение предотвращают образование кристаллов льда, которые губят клетки.

п.11.

Требуется значительное время (~ON), чтобы охладить контейнер для замораживания до +4^оС, поэтому лучше хранить его в холодильнике/холодной комнате.

Дополнения и комментарии людей знающих.

Вадим Шаров

Как мыть культуральный пластик.

Детергентом или хромпиком. Но после хромпика тщательно отмывать. Стерилизовать пластик только ультрофиолетом непрактично - желтеет и портиться, да и не слишком стерильно. Лучше 70% спиртом и чуть чуть на ультрофиолет (30 минут). А лучше (если есть) кобольтовой пушкой.

Как чистить CO₂ инкубатор при заростах.

Все зависит от СО₂ датчика.

Можно медным купоросом или другим веществом с медью, затем вода и 70 % спирт (если датчик это выдерживает). Медный купорос на нержавейку не действует. Можно от купороса не отмывать. Выглядит не очень опрятно, но по опыту и клетки без антибиотиков растут и грибов нет. В поддон к воде добавляем бихромат калия - до желтизны. Воду не в поддон добавляем а в корытце или другую емкость.
Формалином с детергентом.
Азид натрия лучше не использовать. И себя отравишь и если подсушится - будет БАХ.

Можно ли модифицировать поверхнось дешёвого пластика, чтобы использовать его для клеточных культур.

Вообще полчаса в жестком хромпике и даже старые иммунологические платы связывают белки как новые, а клетки растут как звери. Только надо много раз полоскать после хромпика.

Теперь о заморозке.

Лучше чем замораживание в сыворотке (90%) DMSO (10%) не знаю. С фибробластами, даже первичными после такого замораживания не надо мучаться с откруткой от криопротектора.

> Методы > Эукариотические клетки > Основные приёмы работы. Базовые методы работы с эукариотическими клетками.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Снятие клеток с культуральных сосудов Замораживание клеток Размораживание клеток Метод с отмывкой от криоконсеванта Метод непосредственной посадки Определение количества клеток Транспортировка Растворы. PBS (рецепт 1) 10x PBS (рецепт 2) 10x PBS (рецепт 3) 10x HBSS (Hanks' balanced salt solution) 10x Trypsin/EDTA раствор Сыворотка Раствор Версена Антибиотики Ростовые среды Комментарии. Общие. О культуральной посуде По пунктам. Дополнения и комментарии людей знающих. Вадим Шаров	Ольга Смирнова, Лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транспорта, Институт биологии гена; Алексей Солдатов, Вадим Шаров.
Снятие клеток с культуральных сосудов слить старую среду; 2-3 раза промыть клетки HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺) или раствором Версена (~3ml на 25 см²); залить монослой раствором для снятия клеток (чтобы полностью покрывал: ~1ml на 25 см²; но можно и больше, если не жалко); инкубировать при 37⁰С, периодически аккуратно покачивая. Обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10' (время зависит от клеточной линии); когда клетки полностью отделятся от субстрата, добавить полной среды или PBS и тщательно диспергировать клетки; если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток: осадить центрифугированием ~200g, 5' и ресуспендировать в полной среде; считать и субкультивировать. Замораживание клеток только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде; просчитать количество живых клеток; осадить клетки, центрифугируя при 200-400g 5', удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок; ресуспендировать клетки в концентрации 110⁷ - 510⁷ клеток/мл в среде для замораживания с сывороткой или 0.510⁷ - 110⁷ клеток/мл в среде для замораживания без сыворотки; разлить в ампулы (2ml пробирки с завинчивающимися крышками) для замораживания. Охладить ампулы в ледяной бане 5' (или в холодильнике на +4⁰С); клетки необходимо замораживать медленно - понижение температуры со скоростью ~1⁰С в минуту (варианты в зависимости от богатства: (i) программируемый холодильник; (ii) специальный контейнер (от Gibco или Stratagene); (iii) пенопластовая коробка с толщиной стенок ~1см. Контейнер или коробка помещаются в морозильник на -70⁰С - -90⁰С ON); после замерзания ампулы переносят для хранения в жидкий азот. Размораживание клеток Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирование) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (ДМСО, глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полной среде. а. Метод с отмывкой от криоконсеванта клетки быстро оттаять при 37⁰С на водяной бане; поместить 1-2ml клеток в ~25ml полной среды, очень аккуратно перемешать; центрифугировать клетки при ~80g 2-3' и удалить супернатант; аккуратно ресуспендировать клетки в полной среде и посчитать количество живых клеток; рассадить клетки. Количество живых клеток должно быть, по меньшей мере, 310⁵ клеток/мл. б. Метод непосредственной посадки клетки быстро оттаять при 37⁰С на водяной бане; посадить клетки в полной среде. Использовать 10-20ml среды на 1ml замороженных клеток. Необходимо сажать не менее 310⁵ клеток/мл; растить клетки от 12 до 24 часов, затем заменить среду свежей чтобы удалить криоконсервант. Определение количества клеток Количество клеток в суспензии можно просчитать в камере Горяева. Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются. Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~40µl) смешивают с равным количеством 0.4% (w/v) раствора красителя в HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество "квадратов", в которых просчитываются клетки зависит от плотности клеточной культуры и от той точности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток). Камера Горяева. Технические данные. Зазор 0.1mm Сторона малого квадрата 0.05 ±0.001mm Сторона большого квадрата 0.2 ±0.0015mm Сторона сетки 3 ±0.005mm Площадь сетки 9mm². Объем камеры 0.9mm³. Исходная концентрация клеток рассчитывается по следующей формуле: Для клеток неразведённой суспензии: С [cell/ml] = 2.510⁵(количество клеток в одном большом квадрате) С [cell/ml] = 410⁶(количество клеток в одном малом квадрате) Для клеток разведённой в два раза (красителем) суспензии: С [cell/ml] = 510⁵(количество клеток в одном большом квадрате) С [cell/ml] = 810⁶(количество клеток в одном малом квадрате) Транспортировка либо (более предпочтительно) в сухом льду, замороженными; либо при комнатной температуре: клетки выращивают до 60-80% монослоя, удаляют старую среду, культуральный флакон заливают полной средой доверху и плотно закручивают крышкой. При таком способе клетки можно сохранить живыми в течение 2 суток. NB! На наш взгляд, лучше предварительно "кондиционировать" новую среду в CO₂-инкубаторе.