Комментарии.
Общие.
- Принцип метода:
а) pDNA линеаризуется;
б) DNase вносит двухцепочечные разрывы;
в) T4 DNA полимераза достраивает разрывы до тупых концов;
г) самолигирование.
- Сравнение с "классическим" ExoIII/M.B.
преимущества:
1) !!! нет ограничений на линеаризующую рестрикцию,
2) существенно ниже требования к качеству pDNA,
3) более простые ферментативные манипуляции (всё в одной пробирке).
недостатки:
доля колоний, на которых PCR "не идёт", заметно больше;
- NB!:
Cтоит заметить, что на практике фракционирование по времени ExoIII/MB реакции не обеспечивает хорошего фракционирования по размерам. Другими словами, как это ни странно, методы не слишком различаются по тому, сколько клонов требуется взять на PCR для того, чтобы получить весь набор серийных делеций.
По пунктам.
п. 2.
- Важно, чтобы рестрикция прошла полностью, иначе не резанная плазмида может создать высокий фон.
п. 3-11.
- В ходе аналитического расщепления определяется то соотношение DNA/DNase I, при котором получается наиболее равномерный шмер от плазмиды исходного размера до линеаризованного вектора.
п. 12-18.
- Переход к препаративному расщеплению не сложен, т.к. оно отличается от аналитического только заполнением концов с помощь T4 DNA pol.
п. 17.
- pDNA, не расщеплённая DNase I ни разу, идёт заметным бэндом. Это означает, что соответствующие молекулы имеют большую молярную долю, чем молекулы других размеров => если захватить бэнд, они дадут сильный фон.
п. 19.
- Объем бактериальной культуры зависит от размера тех плашек, которые вы используете: обычно 25-50µl вполне достаточно.
п. 20.
- Плашка со средой заматывается в SaranWrap для того, чтобы среда не подсохла на 37oС. Возможны варианты: пакет, парафильм, tape и т.д.
п. 22.
- Определить точный размер вставок с одного прогона сложно, особенно, если анализируется множество клонов. Мы проводим анализ следующим образом:
- на общем форезе определяем "приблизительный" размер фрагментов;
- отбираем несколько избыточное количество (~ в 1.5 раза) клонов с различным размером;
- проводим проверочный форез, нанося клоны в порядке убывания размера. При таком нанесении сравниваются размеры фрагментов, идущих по соседним дорожкам, поэтому ошибка минимальна.
|
