Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Фаг лямбда > Выделение ДНК (качественное).

Выделение ДНК фага лямбда для приготовления вектора.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Выделение DNA фага лямбда.
Для "векторов вставки".
Растворы.
STM
TM
SM
Комментарии.
По пунктам.

    Выделение DNA фага лямбда.

  1. заранее подготовить ночную культуру клеток: 2-3ml LTB/Mg/мальтоза, в 17ml пробирке, бактериальная качалка 200-300rpm, 30oС, ON;
  2. пастеркой выколоть бляшку в 200µl SM + капля хлороформа;
  3. 2 часа на качалке или в холодильнике ON;
  4. к 50µl клеток + 1/2 суспензии фага, 37oС, 30';
  5. фаг/клетки -> в 60ml LTB/Mg в колбе V>150ml;
  6. бактериальная качалка 250-300rpm, 6-8 часов 37oС;

    7. если прошёл "хороший лизис":
  7. + 1ml хлороформа, встряхивать 5';
  8. 54ml -> в центрифужную пробирку, охладить до NT;
  9. + DNase и RNase до 5µg/ml (по 27µl стоковых [10µg/µl] растворов);
  10. NT, 30';
  11. + NaCl (тв.) до 1М (3.15g);
  12. 0oС, 15';
  13. ЦФ 11kg, 4oС, 10';
  14. супер слить через марлю в пробирку с 5.4g PEG 8000;
  15. 0oC 1h;
  16. ЦФ 11kg, 4oС, 10', слить жидкость;
  17. ЦФ еще 3', отсосать остатки жидкости;
  18. используя пипетку с широким отверстием мягко ресуспензировать осадок в SM (1.6ml на 100ml исходной культуры);
  19. экстрагировать PEG и клетки равным объемом хлороформа: вортекс 30''; ЦФ 3kg, 4oС, 15';
  20. на каждый ml суспензии + 0.5g CsCl (тв.);
    21. Ступенчатый градиент CsCl
  21. в ультрацентрифужной пробирке приготовить ступенчатый градиент CsCl. Отметить положение границы 1.50-1.45. наслоить на градиент суспензию из п.21:
    22.   100ml или
    p [g/ml] CsCl SM n
    1.45 60g
    		 85ml
    		 1.3768
    1.50 67g
    		 82ml
    		 1.3815
    1.70 95g
    		 75ml
    		 1.3990
  22. ЦФ 22krpm, 4oС, 2h (должен быть виден слой фага лямбда);
  23. отобрать шприцом слой фага лямбда;
  24. поместить в ультрацентрифужную пробирку и заполнить ее SM/CsCl (p=1.5g/ml),

    25. (Ti 50) 38krpm, 4oC, 24 h,
    (SW 50.1) 35krpm, 4oC, 24 h;

  25. собрать шприцом слой фага лямбда, хранить при 4oС в плотно закрытой пробирке;
  26. убрать CsCl из очищенного бактериофага 2х-кратным диализом 1 час NT против 1000х объема STM;
  27. добавить:

    28. EDTA 0.5M pH8.0 до 20mM,
    ProtK 20µg/µl до 50-100µg/ml,
    SDS 10% до 0.5%;

  28. смешать, 56oС, 1-3h
  29. охладить до NT, мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  30. +4oС, диализ против 3х смен 1000х TE ( pH8.0), по 8h;
  31. определить концентрацию DNA.

    32. Для "векторов вставки".

    Рестрикция, дефосфорилирование, отжиг (совмещен с тепловой инактивацией рестриктазы).

  32. рестрикция (~20µg DNA лямбда);

    33. (33-38 - optional):

  33. мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  34. добавить

    1/10V AcONa
    2xV EtOH, осадить,

  35. промыть 70% EtOH;
  36. растворить в таком объёме TE, чтобы концентрация DNA составила 0.25-0.5µg/µl;
  37. + MgCl2до 10mM;
    38.
  38. 68oС, 5', медленно (~0.5h) охладить до 42oС (в пенопластовой бане);
  39. переставить в термостат на 42oС, 1h;
  40. добавить

    41. H2O 70µl,
    CIAP буфер 10µl,
    CIAP 1u/µl 0.7µl;

  41. 37oС, 30';
  42. добавить

    43. EDTA pH8.0 0.5M 1µl,
    ProtK 20µg/µl 1.5µl,
    SDS 10% 5µl;

  43. 56oС, 1-3h;
  44. мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  45. добавить

    46. 10µl AcONa,
    220µl EtOH, осадить,

  46. промыть 70% EtOH;
  47. растворить в 20µl H2O, определить концентрацию;
  48. хранить при -70oС.

    Растворы.

    STM

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaCl10mM5M100µl
    Tris Cl pH8.050mM1M2.5ml
    MgCl210mM1M500µl
    H2O mQ46.9ml

    TM

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    Tris Cl pH8.050mM1M2.5ml
    MgCl210mM1M500µl
    H2O mQ47.0ml

    SM

    (хранить при 4oC).

    Конц.Сток10ml50ml100ml150ml
    NaCl0.1M5M200µl1.0ml2.0ml3.0ml
    MgSO4*10mM1M100µl0.5ml1.0ml1.5ml
    Tris Cl, pH7.550mM1M0.5ml2.5ml5.0ml7.5ml
    желатин0.01%2%50µl0.25ml0.5ml0.75ml
    H2O mQ9.15ml45.75ml91.5ml137.25ml

    * - добавлять после автоклавирования,
    Стерилизовать автоклавированием.



    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1-20

  • Смотри "Выделение DNA фага лямбда".

    • п 21.

  • двукратное равновесное центрифугирование лямбда в градиенте плотности CsCl. Нужно обязательно ориентироваться по метке между p =1.5 и p =1.45 т.к. в пробирке будут и другие опалесцирующие слои.

    • п. 23, 25.

  • Можно прерваться, оставив суспензию фага на несколько суток при+4oС.

    • п. 26.

  • CsCl нужно убрать потому, что высокая концентрация соли ингибирует работу Proteinase K.
  • Бактериофаг лямбда можно хранить в CsCl при +4oС несколько лет.

    • п. 30.

  • Вместо переосаждения применяется диализ т.к. DNA фага длинная и может при переосаждении рваться.

    • п. 33-38.

  • Мы не можем уверенно сказать, какая из процедур дает вектор более высокого качества - дополнительные экстракции и переосаждения на пользу DNA не идут.

    • п. 33.

  • Очистка от рестриктазы.

    • п. 38.

  • Mg+ требуется для нормального отжига.

    • п. 39, 40.

  • Отжиг плеч фага лямбда. На концах лямбда имеются 12-членные одноцепочечные комплементарные участки. Во время отжига эти участки слипаются, соединяя левые и правые плечи.

    • п. 41.

  • Дефосфорилирование. Если вы действительно хотите получить вектор высокого качества, фосфатазу неплохо было бы откалибровать:
    1. дефосфорилировать различным количеством CIAP ~0.2 µg векторной DNA линеаризованной той же рестриктазой, что и лямбда-вектор;
    2. переосадить;
    3. для каждого образца поставить два лигирования:
      1. на себя,
      2. с 3х кратным избытком недефосфорилированной плазмиды (лучше другого размера);
    4. прогнать результаты лигирования на форезе. Оптимальная концентрация CIAP должна предотвращать лигирование на себя, но не ингибировать лигирование с 3х кратным избытком недефосфорилированной плазмиды.

    п. 45.

  • Очистка от CIAP.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz