- Помыть термоплату и стекло, сполоснуть дистиллятом, поставить сушиться;
Приготовление геля.
- Смешать:
Бис-акриламид | 0.18g |
Акриламид | 3.33g |
Мочевина | 29.4g |
H2O | до 70ml |
10xTBE | 7ml; |
- Подогреть раствор в микроволновой печке 15'' (примерно, до 30oC), помешивать до полного растворения;
- Профильтровывать через 0.45µm фильтр, поставить на дегазацию;
Подготовка термоплаты.
- Растереть марлей 5ml EtOH по поверхности термоплаты;
- Растереть марлей 5ml Repel-silane по поверхности термоплаты;
- Повторить предыдущий пункт;
- Растереть марлей 5ml EtOH по поверхности термоплаты;
- Сухой марлей отполировать поверхность;
Подготовка стекла.
- Растереть марлей 5ml EtOH по поверхности стекла;
- Сухой марлей отполировать поверхность;
- Подготовить раствор Bind-Silan:
EtOH | 5ml |
Уксусная кислота | 125µl |
Bind-Silan | 1µl |
- Нанести 50µl этой смеси равномерно по всей ширине стекла по нижнему краю;
- Нанести типом 50µl этой смеси равномерно по всей ширине стекла, отступив 2-3см от верхнего края;
- Когда смесь подсохнет, отполировать марлей область нанесения;
Заливка "пробки".
- Собрать стекло с термоплатой, положить горизонтально;
- В 15 ml нунке смешать:
Гель | 5ml |
PSA 10% | 50µl |
TEMED | 5µl |
- Залить с нижней стороны геля "пробку" примерно 2см шириной;
Заливка геля.
- В карман для верхнего буфера налить дистиллированной воды, примерно 200ml;
- К гелю после дегазации добавить и смешать:
PSA 10% | 300µl |
TEMED | 30µl |
- Поставить сиквенсовый прибор вертикально, 10ml пипеткой залить гель;
- Положить гель почти горизонтально, так чтобы верхняя сторона была на 2-3см выше нижней;
- Вставить гребенку обратной стороной, зажать область гребенки двумя "бульдогами";
- Отлить 0.5-1ml геля в эппендорф (для контроля полимеризации геля);
- Вылить воду из кармана для верхнего буфера, снять зажимы, не вынимая гребенки, сполоснуть верхнюю часть геля дисстиллятом;
Форез.
- Установить залитый гель в поддон для нижнего буфера;
- Прогреть гель, дважды наливая в карман для верхнего буфера 500 ml нагретого дистиллята( ~55oC);
- Налить в карман для верхнего буфера 500 ml нагретого 1xTBE( ~55oC);
- Налить в карман для нижнего буфера 500 ml не нагретого 1xTBE;
- Вынуть гребенку, промыть карман шприцом с надетым на него желтым носиком;
- Включить префорез, 20'. Мощность тока 65W, температура 52oC;
- Промыть карман, вставить гребенку;
- Денатурировать образцы 3', 95oC;
- Нанести по 3µl на сиквенсовый гель;
- Включить форез. Мощность тока - 5W, температура 52oC;
- Когда образцы войдут в гель (~10'), переключить мощность на 65W, температура 52oC;
Фиксация и сушка геля.
- Положить стекло с гелем на 1h в 10% уксусную кислоту;
- Переложить стекло с гелем на фильтровалку, отрезать скальпелем верх и низ геля;
- Положить влажный кусок Whatmann 3MM на поверхность геля, вместе с гелем снять ватманн со стекла;
- Накрыть гель пленкой "SaranWrap", сушить на гель-драере 2h;
- Заложить на экспозицию, проявить;
|