Выделение геномной ДНК из растений | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Источник: S. O. Rogers & A. J. Bendich Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5; 69-76, 1985 (с модификациями).
Листья можно хранить при -70^оС.
Выход: в зависимости от типа ткани: 0.3 - 200ng DNA на 1mg ткани. В наших руках из листьев арабидопсиса получалось 80ng/mg. Наибольший выход из эмбрионов и листьев, наименьший - из органов хранения крахмала.
Получается ДНК размером 40 - 70kbp. Годится для рестрикции и PCR.
Принцип работы CTAB описан в протоколе "Другие методы осаждения ДНК(РНК) - PEG, Zn, CTAB".
Автор методики не является специалистом по работе с растениями, но работала с этой методикой и она понравилась. Поэтому, если у кого-то есть комментарии или какие-то другие способы, было бы приятно о них узнать.

По пунктам.

п. 1 - 3.

Видимо, если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку и растирать и его тоже. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок (в этом случае имеет смысл добавлять ~20µg tRNA как носитель).

п. 7.

Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1хCTAB буфер до исходного объёма.

> Методы > Геномная ДНК > Выделение из растений. Выделение геномной ДНК из растений.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Растворы. 2xCTAB буфер 5xCTAB буфер Буфер для преципитации HS-TE буфер Комментарии. Общие. По пунктам.	Георгиева София, Институт Молекулярной Биологии
ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелёной (а не темно-зелёной) пудры; подготовить прогретую до 65^оС пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25ml 2x CTAB на 2 - 5g ткани); перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать; инкубировать при 65^оС минимум 20' (лучше 1h, но можно и больше: 2 - 3h); охладить до NT, добавить равный объём Хлороформа:Изоамилового спирта (Ch:I=24:1), перемешивать ~20' NT; ЦФ 5krpm NT, 10'; снять водную фазу, добавить к ней 0.2V 5xCTAB; перемешать, инкубировать при 65^оС 10'; добавить равный объём Ch:I, перемешивать ~10' NT; ЦФ 5krpm NT, 10'; если раствор мутный или большая интерфаза - повторить экстракцию Ch:I (пункты 9 и 10); добавить равный объём буфера для преципитации (можно и 2 - 3 объёма), перемешать и оставить на 1h (или на ночь) при NT; ЦФ 5 - 8 krpm NT, 20' (если ДНК не выпадает, добавить больше буфера для преципитации, оставить на комнатной температуре на 1h, отцентрифугировать); растворить осадок в 1 - 2 ml HS-TE (иногда необходим нагрев до 65^оС); добавить 2V EtOH (абс.), 1 - 2h при -20^оС или 30' при -70^оС; ЦФ 8 krpm 4^оС, 10'; к осадку добавить 200µl дистиллированной H₂O и 100µl 7.5M NH₄Ac (pH 7.5) 20', 0^оС; ЦФ 13 krpm 4^оС, 10'; добавить к супернатанту 2V EtOH (абс.) 20' при -70^оС; ЦФ 13 krpm 4^оС, 10'; сполоснуть 80% EtOH; растворить в TE или H₂O; хранить при -20^оС.