Заранее.
- приготовить смесь для определения активности:
провести отжиг в PCR машине (если в 200 µl пробирках, то разаликвотить так, чтобы получилось не более 100 µl на пробирку):
T = 93oC, 3';
T = 37oC, 15';
при работе держать в ледяной бане, хранить при -20oC (размораживать так, чтобы температура не поднималась выше NT);
Перед использованием.
рассчитать необходимое количество смеси для определения активности (4 (или 2) µl на одну реакцию);
добавить меченный a[32P]dATP из расчета > 5 µCi на 80 µl смеси;
Реакция.
приготовить разведения Taq pol в Dilution Buffer;
к 4(2) µl смеси добавить 1(0.5) µl раствора Taq полимеразы (в ледяной бане!!!), смешать, затем (лучше в PCR машине):
T=37oC, 1';
T=72oC, 15';
T=0-4oC, по крайней мере 2';
поместить в лёд, не вынимая изо льда добавить к каждой пробирке 1 µl 0.1M EDTA;
определить процент включения (см. "Определение процента включения.");
включение (теоретическое) 100% соответствует концентрации полимеразы 0.2u/µl (соответственно, например 3% - 0.006u/µl)
