Приготовление препаратов политенных хромосом.
- посадить родителей (~20 мух на пробирку с кормом), ~1 сутки при 25oС;
- сбросить родителей, выращивать личинки при 16oС с I до III возраста (~7-8 дней);
- слюнные железы вырезать в капле 45% уксусной кислоты. Тщательно удалить жировое тело;
- с помощью препаровальных иголок перенести железы в новую каплю на чистое предметное стекло, подписанное алмазом;
- накрыть покровным стеклом и вращательным движением расправить хромосомы;
- фильтровалкой убрать избыток уксусной кислоты;
- поместить стекло в камеру с жидким азотом, ~20';
- сколоть покровное стекло толстым лезвием;
- препарат "провести по спиртам" в 50 ml стаканах (до 100 стёкол без смены растворов):
- 70% EtOH, окунуть 3-4 раза;
- 96% EtOH, 5';
- 96% EtOH, 5';
- сушить на воздухе, ~10';
- препараты можно хранить в холодильнике (+4oС) до 6 месяцев.
Приготовление зонда.
- приготовить зонд, используя [H3] dNTP’s, (можно брать сразу несколько меченых букв);
- после чистки на spin-колонке дополнительно чистить Ф:Х, Х;
- определить активность синтезированного зонда на ФЭУ-счётчике;
- добавить
NaCl 5M => 1/25V,
EtOH (96%) => 2.5V,
осадить, промыть 70% EtOH, высушить;
- растворить в гибридизационном буфере из расчёта 105cpm/µl (можно хранить более года при -20oС)
Подготовка препаратов к гибридизации.
- просмотреть препараты под микроскопом, обвести участки с хорошо расправленными хромосомами алмазным маркером, пронумеровать стекла, отметить не самые удачные препараты (их используют как контроль и проявляют в первую очередь);
- инкубировать препараты в 2хSSC 65-70oС, 30';
- "провести по спиртам" (до 30 стёкол без смены растворов):
50ml стаканы
- 70% EtOH, окунуть 3-4 раза;
- 70% EtOH, окунуть 3-4 раза;
100ml стеклоприёмники
- 70% EtOH, накопить стёкла после (I) и (II);
- 96% EtOH, 15';
- 96% EtOH, 15';
- подсушить на комнатной температуре, 10-15';
- денатурировать хромосомы 1' в 0.07N NaOH (приготовить свежий из 0.7N NaOH стока);
- "провести по спиртам" (см. п.19.). Спирты после этого вылить.
Гибридизация.
- гибридизационную смесь с зондом денатурировать 65oС, 20', сразу в лед на 2';
- наносить 1-2µl на пятно ( в зависимости от размера пятна);
- наложить покровное стекло (следить, чтобы оно легло без пузырей). Замотать парафильмом, гибридизовать при 37oС 14-16h во влажной камере (фильтровальная бумага смоченная 2хSSC).
Отмывка.
- отмывать 3-4 раза в 50ml 2xSSC, 37oС, по 30';
- "провести по спиртам" (см. п.19);
- уложить в коробочку, переписать порядок препаратов;
Авторадиография.
- приготовить для работы в тёмной комнате:
- для расплавления эмульсии - водяную баню на 50oС;
- фильтровальную бумагу;
- колодку (подставку), вокруг которой будут сушиться стекла;
- кусочки парафильма, чтобы замотать эмульсию;
- коробку с препаратами;
- черную фотобумагу (завернуть коробку);
- резинки (замотать коробку);
- фольгу (завернуть эмульсию, если старая фольга порвется);
- окунуть препарат в эмульсию нагретую до 45-50oС на 20-30'';
- выставить на фильтровалку рядом с колодкой эмульсией вниз, высушить при NT 10-15';
- сложить препараты в коробочку, отделив контрольные препараты;
- записать с какой стороны эмульсия, завернуть в черную бумагу;
- экспонировать от 3х суток и более (время экспозиции подобрать, проявляя контрольные препараты).
Проявление.
- проявлять 2-3';
- сполоснуть водой,
- фиксировать 15' (любой фиксаж),
- сполоснуть водой;
- окрасить разведенной гимзой (1:20 в H2O) 1-2'.
|