Получение серийных делеций с помощью Exo III/MB nuclease | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Схема получения серийных делеций:

а) молекула pDNA линеаризуется таким образом, что векторный конец оказывается защищённым от действия ExoIII (либо 4^хчленным 3'-выступающим концом, либо заполненным тионуклеотидами 5'-выступающим), а конец вставки - нет.

г) самолигирование, трансформация.

ExoIII обладает непроцессивной 3'-нуклеазной активностью (фермент покидает субстрат после отщепления одного нуклеотида). Это гарантирует, что вся предоставленная двухцепочечная DNA будет превращаться в одноцепочечную в приблизительно равном темпе.
Подобрать с первого раза режим расщепления ExoIII непросто. Обычно это удается лишь в случае, когда нужно обработать целую серию матриц. Первый эксперимент (для первой матрицы) будет, вероятно, неудачным, поэтому надо уменьшить число промежуточных точек и рассматривать его как прикидочный.

По пунктам.

п. 1.

Иначе ExoIII будет начинать расщепление начиная не только с конца вставки, но и с одноцепочечных разрывов.

п. 2.

Для проверки рестриктаз удобно использовать вектор, из которого был вырезан multiple cloning сайт.

п. 5.

Очистка от рестриктаз.

п. 8.

Промежутки времени выбираются так, чтобы изменение длины pDNA было ~1/2 от той длины, которая уверенно читается на сиквенсовом геле.
длина участка, переводимого в одноцепочечную форму за 1 минуту Exo III (20u/1pmol DNA концов):

37^oС	~290-400
34^oС	~270-370
30^oС	~170-230
23^oС	~90-130

п. 9.

Активность ExoIII сильно подавляется кислым буфером для Mung Bean нуклеазы.

п. 10.

Тепловая инактивация ExoIII.

п. 13.

Электрофорез служит как для выделения молекул нужного размера, так и для очистки DNA от Mung Bean нуклеазы и её буфера.

п. 17.

В качестве праймеров используются праймеры из вектора, фланкирующие полилинкер. С помощью PCR контролируются:

размер вставки,
сохранность участка вектора, с которого будет проводиться сиквенс (иногда подъедается и векторный конец).

> Методы > Серийные делеции для сиквенса > С помощью Exo III/MB nuclease. Получение серийных делеций с помощью Exo III/MB nuclease.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Заполнение 5'-выступающих концов тиопроизводными. Растворы. 2х ExoIII буфер 1x Mung Bean dilution буфер 10x Mung Bean reaction буфер Комментарии. Общие. По пунктам.
почистить pDNA CsCl или другим методом так, чтобы в результате суперскрученная DNA составляла >90%; (optional) проверить используемые рестриктазы на отсутствие ник-активности; резать pDNA двумя рестриктазами (рестриктазой, дающей 3'-выступающий конец со стороны вектора и рестриктазой, дающей 5'-выступающий или тупой конец со стороны вставки), проверить полноту рестрикции на форезе; Ф:Х, Х, переосадить; для каждой контрольной точки приготовить смесь из 0.8µl 10x MB.buffer + 6.2µl H₂O; приготовить общую "Exo III смесь" из расчёта на каждую контрольную точку: резанная pDNA 0.2µg, 2x Exo III buffer 0.5µl, свежий 100mM bMeEtOH 0.1µl, Exo III 20u/pmol концов, H₂O до суммарного объёма 1µl; 0.2µg 3kb фрагмента => ~0.1pmol одного конца, т.е. 2u Exo III на точку (пересчёт веса в моли для ДНК на странице "Нуклеотиды, нуклеиновые кислоты"); инкубировать на подходящей температуре; переносить 1µl аликвоты в пробирки из п.6 через равные промежутки времени, пробирки -> в жидкий азот; когда все аликвоты отобраны: 68^oС, 15', затем в лёд; к каждой пробирке + 0.6u MB.nucl. (разведённой в 1х MB. dilut buffer); 30^oС, 30'; + 10х буфер внесения (остановить реакции), на форез; выделить фрагменты в PEG/TAE; самолигирование (NT, ~2h); трансформация; анализ клонов с помощью PCR; подходящие по размеру клоны -> на выделение одноцепочечной DNA. Заполнение 5'-выступающих концов тиопроизводными. разрезать плазмиду рестриктазой, дающей 5'-выступающий конец (10-20µg в 500µl); 75^oС, 15'; + 2µl 1mM стока thio-dNTP, + 5u Klenow pol.; NT, 10'; Ф:Х, Х, осадить EtOH; проверить эффективность защиты расщеплением аликвоты ExoIII нуклеазой; провести вторую рестрикцию.