Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Экспрессия белков > Taq полимераза.

Очистка Taq полимеразы (клон pTp4).


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Приготовление стоковой культуры.
Приготовление стартовых аликвот культуры-продуцента.
Выделение Taq полимеразы.
Обработка DNase.
Подготовка колонки.
Оценка связывания Taq полимеразы с Bio-Rex 70.
Растворы.
Terrific Broth, Amp(100 µg/ml), Glucose 2%
Buf.A.
Buf.B.
Buf.C.
Buf.C(50mM KCl)
Buf.C(400mM KCl)
Buf.D.
PMSF 0.1M
Dilution Buf.
Комментарии.
Общие.
По пунктам.

    Приготовление стоковой культуры.

  1. со стока (-70oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой: {Terrific Broth, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%};
  2. отобрать несколько индивидуальных колоний, поместить их по отдельности в 5ml среды {Terrific Broth, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в 17-50ml пробирках;
  3. 200-300rpm, 30(37)oC, ON;
  4. из каждой пробирки отобрать в стерильных условиях по 1ml, 2х промыть 1.0ml Terrific Broth (оставшуюся часть культуры поместить на +4oC);
  5. ресуспензировать в 2ml среды {Terrific Broth, Amp 100 µg/ml, IPTG 0.5mM};
  6. 200-300rpm, 37oC, ~3h;
  7. ЦФ 14krpm, 10'';
  8. сполоснуть 200 µl Buf.A (ресуспензировать; ЦФ 14krpm, 10'');
  9. ресуспензировать в 40 µl {Buf.A+~1mg/ml lysozym+1mM PMSF};
  10. + 40 µl Buf.B, смешать;
  11. 74oC, 45';
  12. быстро охладить в ледяной бане;
  13. ЦФ 14krpm, 10', NT;
  14. отобрать супернатанты,
  15. для каждого оценить полимеразную активность;
  16. определить, какие клоны продуцируют активную Taq полимеразу;
  17. к соответствующим оставшимся частям культуры (см. п.4) добавить DMSO до 7%, разаликвотить по 100 µl, заморозить в ж. азоте, хранить при -70oC;

    18. Приготовление стартовых аликвот культуры-продуцента Taq полимеразы.

  18. разморозить аликвоту из п.17, перенести её в 300ml среды {Terrific Broth, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере 1L колбе;
  19. 200-300rpm, 37oC, до OD600=0.6-0.8 (но ниже 1.0!!!);
  20. добавить к культуре стерильный глицерол до 10%;
  21. разаликвотить:

    22. - часть - по 1.5ml культуры в ~20-30 2ml микроцентрифужных пробирок,
    - остальное - по 40ml в 50ml центрифужные пробирки;

  22. охладить пробирки во льду;
  23. заморозить в жидком азоте;
  24. перенести на -70oС в какой-то чётко подписанной таре, записать, где они хранятся.

    25. Выделение Taq полимеразы.

  25. разморозить 1.5ml аликвоту из п.21, перенести её в 1L среды {Terrific Broth, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере 2L колбе;
  26. 200-300rpm, 37oC, до OD600 слегка больше 2;

    27. * при использовании в качестве стартовой культуры pTP4 (№9) 3.2ml (A600=0.4) -> 1L (A600=2.3) заняло 12h;

  27. ЦФ 4krpm, 10', NT;
  28. 2x промыть клетки 100ml Terrific Broth (ЦФ 4krpm, 10', NT);
  29. ресуспензировать в 1.5L среды {Terrific Broth, Amp 100 µg/ml, IPTG 0.5mM};
  30. (optional)

    31. отобрать 1ml (не индуцированный контроль);

  31. 200-300rpm, 37oC, ON;

    32. * pTP4 (№9) за время индукции 13h -> плотность возросла от A600=1.9 до A600=2.2;

  32. (optional)

    33. * отобрать 1ml (индуцированный контроль);

  33. сполоснуть 100ml Buf.A (ресуспензировать; ЦФ 4krpm, 10', 4oС);
  34. ресуспензировать в 40ml Buf.A(с 1mM PMSF);
  35. + 40ml Buf.B(+ ~40mg lysozym), быстро и хорошо смешать;

    36. Внимание!!! Далее, во время прогрева и при подготовке к центрифугированию важно как можно меньше взбалтывать пробирку. Взбалтывание приводит к тому, что после центрифугирования в супернатанте остаётся много DNA - раствор невозможно профильтровать.
  36. 74oC, 45';
  37. охладить в ледяной бане ~5-10';
  38. ЦФ >4krpm (лучше ~10-20krpm), 1h, 4oС;
  39. снять супернатант (должно получиться ~84ml), профильтровать через по крайней мере 0.45 µm фильтр, отобрать 45 µl - контроль после центрифугирования (на этом этапе останавливаться нельзя - сразу переходить к п.41);
  40. на этом этапе лучше проконтролировать полимеразную активность:

    41. а) приготовить разведения осветлённого лизата в 1х буфере для Taq pol/BSA 0.1mg/ml:

    5 µl + 95 µl => 1:20,
    5 µl предыдущего раствора + 120 µl => 1:500,
    5 µl предыдущего раствора + 10 µl => 1:1500,
    5 µl предыдущего раствора + 11.6 µl => 1:5000;

    б) для определения активности использоватьразведения 1:500,1:1500, 1:5000; для осветлённого лизата должна получиться активность ~40u/µl;

  41. разбавить осветлённый лизат Buf.C (50mM KCl, 0.5mM PMSF) в отношении ~1:1;
  42. нанести ~450ku Taq pol на 30ml колонку Bio-Rex 70 (см. "Подготовка колонки."), предварительно уравновешенную Buf.C (50mM KCl) (~15 000u на 1ml Bio-Rex 70);
  43. промыть колонку 150ml Buf.C (50mM KCl, 0.5mM PMSF);
  44. элюировать полимеразу 150ml Buf.C (400mM KCl, 0.5mM PMSF), элюат собирать следующим образом (для 30ml колонки):
    1. в отдельную пробирку первые 10ml;
    2. 20 фракций по 1ml;
    3. всё остальное - в сброс;
  45. промыть колонку 100ml Buf.C (50mM KCl), колонку можно хранить несколько месяцев при +4oC;
  46. содержимое каждой из пробирок из п.34 перемешать и нанести по 1 µl из каждой фракций на Whatman 3MM (смотри "Определение концентрации белка на 3ММ.");
  47. объединить фракции, в которых сошёл пик белка (должно быть 4-6 фракций);
  48. провести очистку остального материала осветлённого лизата, отобрать 1/1000 материала - контроль после индукции (~15 µl для 1 литра исходной культуры);

    49. Обработка DNase.

  49. к материалу из п.48 добавить:

    50. 1M MgCl2 до 10mM;
    DNase I из расчёта ~2u/ml

  50. 37oC, 40';
  51. 80oC, 15';
  52. диализовать против ~20-40 кратного объёма Buf.D в три смены:

    53. "1" -> NT (или лучше +4oС), 2-3h,
    "2" -> NT (или лучше +4oС), 2-3h,
    "3" -> 4oС, ON;

  53. извлечь Taq pol. из диализного мешка, определить активность, разаликвотить, подписать;
  54. хранить основной сток при -70oС, рабочее количество - при -20oС;
  55. для приготовления Taq pol c активностями 1u/ µl; 5u/ µl нужно использовать Dilution Buf.

    56. Подготовка колонки.

  56. если готовится новая колонка:

    57. "отмучить" смолу в воде (получается ~1.8 ml на 1g сухого Bio-Rex 70):

    * взболтать смолу, дать осесть под действием силы тяжести основной фракции, мутный супернатант слить;
    * повторить 2-3 раза, пока вода после осаждения основной фракции не будет оставаться прозрачной.

    уравновесить Buf.C+50mM KCl,

    * добавить 10х Buf.C до 1х и 2M KCl до 50mM;
    * довести pH (контролировать по pH-strip) до ~7.4 добавив HCl 37% (~1ml на 30ml/60ml 50% суспензии/ Bio-Rex 70);
    * дать смоле осесть, супернатант снять, ресуспензировать смолу в Buf.С/50mM KCl.

    Оценка связывания Taq полимеразы с Bio-Rex 70.

  57. 1. приготовить по 500 µl смеси Bio-Rex 70 + осветлённый лизат в буфере С/50mM KCl/:
    58.   50%BioRex70
    в буфере
    С/50mM KCl/
    (µl)    		осветлённый лизат
    (µl)    		С/50mM KCl/
    (µl)
    1 25 50 425
    2 50 50 400
    3 75 50 375
    4 100 50 350
    5 150 50 300
    6 200 50 250
  58. смешивать на орбитальном смесителе ~20' при NT;
  59. осадить ЦФ (обязательно низкоскоростное, 3krpm для микроцентрифуги или 2krpm для большой) ~3-4';
  60. снять по 100 µl супернатанта в подписанные пробирки, оставшийся супернатант аккуратно удалить;
  61. промыть смолу 2х по 1ml С (50mM KCl);
  62. элюировать связавшийся белок в 100 µl С (400mM KCl) (смешивать на орбитальном смесителе 5' при NT);
  63. убрать смолу высокоскоростным центрифугированием ~2';
  64. снять по 50 µl супернатанта в подписанные пробирки;
  65. либо определить активность во фракциях из п.60 и п.64, используя разведения 1:100 и 1:1000; либо проконтролировать количество связавшегося белка окрашиванием на 3MM.
  66. если колонка готовая:

    67. промыть колонку 150ml Buf.C+50mM KCl, проконтролировать pH;

    Растворы.

    Terrific Broth, Amp(100 µg/ml), Glucose 2%

    (готовить перед использованием):

    Конц.Сток1L
    Terrific Broth~1х1х950ml
    Glucose2%40%50ml
    Amp100 µg/ml50mg/ml2ml

    Buf.A.

    (хранить при +4oС), готовить как 10х:

    1х10хСток50ml250ml
    Tris Cl, pH7.950mM0.5M1M25ml125ml
    Glucose50mM0.5M2M12.5ml62.5ml
    EDTA1mM10mM0.5M1.0ml5.0ml
    H2O  mQ11.5ml57.5ml

    Buf.B.

    (хранить при +4oС)

    Конц.Сток100ml250ml
    Tris Cl, pH7.410mM1M1ml2.5ml
    KCl50mM2M2.5ml6.25ml
    EDTA1mM0.5M0.2ml0.5ml
    Tween 200.5%
    (v/v)    		100%0.5ml
    0.556g    		1.25ml
    1.39g
    Triton X100
    (или Nonident P-40)    		0.5%
    (v/v)    		100%0.5ml
    0.532g    		1.25ml
    1.33g
    H2O mQ95.32ml238.3ml

    Buf.C.

    (хранить при +4oС), готовить как 10х:

    1x10xСток500ml
    Hepes, pH7.420mM0.2M1M100ml
    EDTA1mM10mM0.5M10ml
    Tween 200.5% (v/v)5% (v/v)100%25ml
    Triton X1000.5% (v/v)5% (v/v)100%25ml
    H2O  mQ340ml

    Buf.C(50mM KCl)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток300ml800ml
    Buf.C1x10x30ml80ml
    KCl50mM2M7.5ml20ml
    PMSF* в изопропаноле0.5mM100mM1.5ml4ml
    H2O mQ261ml696ml

    * добавлять непосредственно перед использованием из расчёта 0.5ml на 100ml.

    Buf.C(400mM KCl)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток300ml800ml
    Buf.C1x10x30ml80ml
    KCl400mM2M60ml160ml
    PMSF* в изопропаноле0.5mM100mM1.5ml4ml
    H2O mQ208.5ml556ml

    * добавлять непосредственно перед использованием из расчёта 0.5ml на 100ml.

    Buf.D.

    для диализа (хранить при +4oС)

    Конц.Сток500ml800ml
    Hepes, pH7.4, p=1.06420mM1M10ml
    10.64g    		16ml
    17.02g
    KCl100mM2M25ml40ml
    EDTA0.1mM0.5M100 µl160 µl
    Glycerol50%87%
    p=1.23    		287ml
    353g    		459ml
    565g
    PMSF*в изопропаноле0.5mM100mM2.5ml4.0ml
    DTT*1mM1M0.5ml0.8ml
    H2O mQ175ml280ml

    * добавлять непосредственно перед использованием.

    PMSF 0.1M

    (хранить при -20oС)

    Конц.Сток20ml
    C7H7FO2S100mM174.2g/M0.348g
    Isopropanol  20ml

    Dilution Buf.

    для разведенияTaq pol(хранить при +4--20oС)

    Конц.Сток50ml
    Hepes, pH7.420mM1M1ml
    KCl100mM2M2.5ml
    EDTA0.1mM0.5M10 µl
    Glycerol50%87%
    p=1.23    		28.7ml
    35.3g
    Gelatin0.005%2%125µl
    DTT*1mM1M50 µl
    H2O mQ17.62ml

    * добавлять непосредственно перед использованием.
    Использовать 10ml рабочими порциями, к которым добавлять по 10µl DTT 1M.



    Комментарии.

    Общие.

  • pTP4 конструкция была приготовлена точно так же, как описано в статье Engelke et al. 1990 Analytical Biochemistry, Dec 191(2) p.369-400.
  • Приведённая методика - изменённый вариант метода, описанного в оригинальной статье (опущена преципитация PEI), добавлена обработка DNase I.
  • Taq полимераза - фермент термостабильный, это даёт возможность практически всю очистку проводить при NT.
  • Нормальный выход: ~1.0-1.6млн. единиц на 1 литр индуцированной культуры.
  • Методика определения активности находится в "Определение активности полимеразы.".
  • Если есть желание/необходимость проследить за ходом очистки на форезе используются контроли из пунктов 30, 32, 39, 48. В каждом случае отбирается ~0.1% материала. То есть, если отобранный материал развести (для 30 и 32 - после переосаждения) в одинаковом объёме буфера для нанесения на SDS-PAAG, то будет весьма удобно оценивать потери в ходе очистки.
  • Штаммы №14 и №9 (мы не знаем, что это за клетки: они получены нами из Берлина) дают "плохо фильтрующиеся" супернатанты. Их вообще можно профильтровать лишь в том случае, если пробирка не взбалтывается.

    • Штаммы BL21 и INVaF' образуют после прогрева осадок, хорошо отделяющийся от супернатанта. Они хорошо фильтруются вне зависимости от того, болтали пробирку или нет. Но, как назло, Берлинские штаммы дают заметно дольше фермента.

    По пунктам.

    п.1-24.

  • Клон-продуцент нестабилен, поэтому необходим этап отбора "хорошего" клона. Способ частичной очистки Taq полимеразы на этапе селекции - уменьшенная копия maxi-prep очистки.
  • При приготовление стоковой культуры имеет смысл определять активность в два этапа:
    1. по 0.5 µl из супернатантов п.14 (оценить, какие из культур вообще продуцируют Taq pol.);
    2. для оценки, какая из культур лучше: приготовить для каждого позитивного клона 3-4 десятикратных разведения (см. "Определение активности полимеразы.") и измерить активности для этих разведений;

    Внимание!!! Ни в коем случае нельзя судить об активности по одному измерению, т.к. слишком большое количество фермента ингибирует реакцию.

  • Мы (один раз) пробовали экспрессировать Tag pol. в штамме BL21, но почему-то получилось, что фермент на Bio-Rex 70 не сел.

    • п.1.

  • 2% глюкоза выступает здесь как репрессор lac промотора (под контролем которого находится ген Taq полимеразы). Катаболитная репрессия - хоть и очень простой метод, но вполне действенный: например, на чашках с 2% глюкозой сине-белый тест не работает.

    • п.3.

  • Инкубация при 30oС - чтобы культура не "перерастала".

    • п.4.

  • Промывка Terrific Broth, чтобы перед индукцией избавиться от глюкозы. 2х промывка проводится следующим образом:

    • * поместить 1ml культуры в стерильную 1.5ml ЦФ-пробирку;
    * ЦФ либо 2' при 6krpm (в микроцентрифуге с регулируемой скоростью вращения), либо 10'' при 14krpm;
    * убрать супернатант, бактерии ресуспензировать на вортексе в 1.0ml Terrific Broth;
    * повторить: п.2-3.

    п.11.

  • Большинство белков E.coli после 74oC, 45' денатурирует, а Taq полимераза - нет.

    • п.28.

  • Отмывку проводить в металлических ЦФ стаканах. Перед этим стаканы и пластиковые крышки тщательно вымыть, протереть спиртом и высушить под UV (стерилизация). Ресуспензирование и т.п. проводить на столе (не под ламинаром), нужно стараться делать это чисто.

    • п.36.

  • Обратить внимание на то, чтобы уровень жидкости в пробирке был не выше уровня жидкости в водяном термостате (иначе будет плохой теплообмен).

    • п.42.

  • Bio-Rex 70 /Bio-Rad/ - ионообменная смола с функциональной группой: R-COO-. На ней не должны задерживаться нуклеиновые кислоты (если, конечно, раствор перед нанесением на колонку был профильтрован).

    • п.52.

  • Во время диализа объём препарата значительно (~в два раза) уменьшается.

    • п.55.

  • Проверить работу полимеразы в PCR-реакции, проведя 8 реакций с 2х-кратными разведениями фермента, так, чтобы для первой пробирки было ~5u/15 µl.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz